万历十六年春三月十六，圣驾自京师起行。此次南巡，为免地方迎驾靡费，大部分行程在运河。

万历四年漕运改海，朝廷继续保留运河衙门协调各地维护运河畅通，并改钞关税为地方税，允许沿河各省收过河钱。因船运加上钞关之费后仍远低于陆路，因此没有了漕运功能的运河繁荣依旧。运河所在地的地方官无保漕之责，而有关税之惠，立成天下第一等的肥缺。

过了年，政事堂即将钧旨下达，将皇帝南巡的大致路线和时间通知各省。随后皇帝也专为此事下旨，要求各地不得大兴土木，擅建行宫，靡费民力。

因南巡经过皇后家乡苏州，故李太后就没有与皇后相争这陪伴的机会。而皇后在侧，朱翊钧也不好意思带太多妃嫔，只能由皇后选了几个老实巴交的伴驾。

陈太后本来要凑热闹，奈何入春之后咳嗽不断，身体难以支撑，只好陪着李太后在京师守家。太子已经十一岁，身体康健，此次也得以伴驾南巡。

有大臣劝谏皇帝留太子监国以备不测，被朱翊钧大骂一通后，再无杂音出来。至于伴驾大臣，与皇帝第一次北巡塞罕坝时不同，此次除罗万化等少数几个留守之外，总理大臣与尚书近乎全员出动。